L'opera di realizzazione, iniziata nel 1068, sotto il pontificato di Gregorio VII, fu ultimata nel 1088, sotto Urbano II. La cattedrale di Otranto è la sintesi di stili differenti come quello paleocristiano, quello bizantino e quello romanico, perfettamente armonizzati nel suo insieme.

La facciata colpisce immediatamente  per il grande rosone rinascimentale che campeggia sul portale d'ingresso, sormontato dallo stemma dell'arcivescovo Adarzo di Santander. 

La pianta è a croce latina a tre navate, con un'abside semicircolare e due cappelle laterali. Vi sono due file di colonne di granito, in totale 14, sormontate da capitelli di vario stile. Nel 1698 la cattedrale fu dotata dello splendido soffitto a cassettoni in legno coloro oro, su fondo nero e bianco. 

Nell'agosto del 1480, la cattedrale fu teatro di un'orribile carneficina: dopo diversi giorni di assedio, i turchi espugnarono la città ed entrarono nella chiesa sterminando il clero ed i civili che non vollero rinnegare la fede cristiana. In seguito la cattedrale venne trasformata in moschea e furono distrutti tutti gli affreschi risalenti al XIII secolo. Nel 1481, dopo la liberazione di Otranto ad opera delle truppe di Alfonso V di Aragona, la cattedrale fu nuovamente rimaneggiata.

La cicatrice lasciata nella storia di Otranto da questi terribili eventi ha per sua testimonianza la cappella dei martiri, situata sul fondo della navata destra, in cui sono conservati i resti mortali dei santi martiri di Otranto. Le reliquie sono deposte in sette grandi armadi e dietro l'altare è conservato il sasso del martirio sul quale, secondo la tradizione, avvenne la decapitazione.

Di enorme impatto è l'ampia decorazione musiva pavimentale che si sviluppa lungo le navate, il presbiterio e l'abside. Fu eseguita tra il 1163 e il 1165 da un gruppo di artisti capeggiati da Pantaleone, un monaco basiliano del monastero di San Nicola di Casole.

Il mosaico rappresenta un percorso attraverso un labirinto teologico con numerosi riferimenti simbolici non sempre di facile interpretazione. Le immagini, disposte lungo lo sviluppo dell'Albero della vita, ripercorrono l'intera storia dell'esperienza umana, dal peccato originale al giudizio universale ed infine alla vita eterna, riprendendo episodi ed iconografie bibliche, ma anche attingendo a bestiari ed altri testi di sapienza medievali. Il risultato è un complesso trattato teologico per immagini che non manca di affascinare il visitatore. 

Degna di nota è anche la cripta, che si snoda nell'area al di sotto dell'abside, del presbiterio e di parte dell'aula e risalente al XI secolo. Essa possiede tre absidi semicircolari e si caratterizza per le quarantotto campate intervallate da oltre settanta tra colonne, semicolonne e pilastri. La particolarità di queste è nella diversità degli elementi di sostegno, provenienti da edifici antichi e altomedievali, dal vario repertorio figurativo.

Di grande pregio sono anche gli affreschi superstiti che abbracciano un arco cronologico dal Medioevo al Cinquecento.